急性化脓性阑尾炎

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宏基因组病原体检测能用作药敏参考吗 [复制链接]

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由于抗生素的广泛应用,耐药菌给临床诊断与治疗带来了巨大挑战,部分“超级细菌”的耐药程度更是达到了巅峰,出现“无药可用”绝境场面。随着高通量测序技术的广泛应用,以高通量测序技术中的宏基因组测序技术(mNGS)为主的研究技术,在感染性疾病的病原微生物检测方面,也得到了前所未有的应用。以其检测通量高、检测范围全面、检测周期稳定、可发现新的病原体等优势,为临床病原微生物的检测技术的带来了新的希望。

mNGS检测技术在病原微生物检出方面具有显著优势,那么该技术在检测病原体种类的同时,是否可以同时将细菌的耐药性检测出来呢?

细菌耐药机制

首先,我们先回顾一下细菌的耐药性机理。当长期应用抗生素时,占多数的敏感菌株不断被杀灭,而耐药菌株反而得以大量繁殖。当敏感株被耐药株替代时,细菌的耐药率显著升高。

目前了解细菌的主要的耐药机制包括:

产生灭活酶

改变药物靶点

改变细胞膜的通透性

改变细胞代谢方式

其次,我们还得回顾一下基因信息流-中心法则(图1),细菌遗传物质(DNA)的改变会引起其基因表达出的mRNA序列发生改变,从而改变其翻译出的蛋白质的序列或者影响蛋白质的后期加工。最终导致细菌蛋白质的功能和数量上发生变化,从而调控其对药物的敏感性。

图1-中心法则

mNGS测序技术原理

mNGS技术的基本原理是使用鸟枪法-随机打断测序以获取生物细胞基因组中的目的基因(图2),其具有速度快、简单易行、成本较低的特点,所以从技术理论上来说,mNGS测序可以进行细菌耐药基因的检测。

图2鸟枪法测序原理

mNGS测序技术到底能否用于临床上的细菌耐药基因检测呢?

其实还有很多现实的问题没有解决,具体如下:

1测序数据中宿主-人的序列太多了

在临床样本中,人和病原体细胞同时存在,也就意味着测序获得的数据将同时存在着人与病原体的基因组信息。人的细胞数目和基因组DNA大小均比病原体占据优势,而mNGS技术是鸟枪法检测技术,所以测序数据中样本中很多的人的基因组序列,而细菌的序列偏少,细菌的基因组覆盖度不够,这样将会影响细菌基因组上的耐药基因的检测效率。

2细菌基因组上有耐药基因,但耐药基因不一定会表达

mNGS技术是从基因组DNA的角度进行耐药基因的检测,那么基因组上有耐药基因,这个基因就一定表达了吗?我们需要打一个问号,有耐药基因≠耐药基因会表达出来。细菌的耐药性是蛋白层面表现,即表达层面的表型,所以基因组上的耐药基因与耐药表型不能画等号。

3细菌基因组上的耐药基因的多少与临床耐药性的相关性难明确

细菌基因组上存在耐药基因数目如何定量,并与临床建立联系呢?我们并不能简单认为耐药基因的拷贝数越多,耐药性就越强。目前没有相关的数据信息告诉我们二者之间的关联性。

4检测到了耐药基因,但无法确定具体是来自哪一个细菌的

由于宏基因组检测技术将会对标本中病原体的基因统一检出,当病原体基因组序列存在同源性时,就无法很好地分辨该耐药基因的来源了。

5细菌耐药性存在多基因控制模式

细菌耐药性可由单一基因或多基因控制,但由于无法确认耐药基因来源进而建立多基因联系,因此对多基因控制导致的耐药仍难以确认。另外,多基因与耐药的量化

可能存在单一基因控制或多基因控制的,那么有没有数据告诉我们这个信息呢?没有。同时如果是多基因控制模式,那么这些基因之间是如何量化控制细菌耐药性的呢,我们也不清楚。

6检测到的耐药基因可能已“死”

由于mNGS检测本质是对病原体核酸进行检测,也就是说,已死亡的病原体同样能被检测出来。因此,如果无法分辨检出的核酸是否来自活动性病原体,便无法确认所检出的耐药基因药物敏感性之间的关系。

7检测到的耐药基因可能来自于定植菌

与上一点相类似,对人体无害的定植菌的核酸同样会被检测得到,而这些定植菌的基因组也同样可能包含耐药基因,而被检出。因此,如果脱离致病性谈病原体的耐药性,并不符合药敏检测的初衷。

8耐药基因检测与临床快速检测需求之间的矛盾

mNGS技术由于通过随机打断测序的方式,随机获得生物基因组中的基因序列,其获取基因片段的多少与测序数据量有关。同一个样本的测序数据量越大,随机获得基因组上的基因理论上也越多,基因组的覆盖度就越全面。而样本测序数据量越大,对后续生物信息分析的时间与资源要求也越多,同时实验和分析的成本也越高。因此,对耐药基因进行深度探究,并不能满足mNGS技术作为一种快速的病原体检测的时效性要求。

综合以上信息,我们发现mNGS测序技术在细菌耐药性检测方面只能说理论上可行,但是实际仍有诸多问题有待解决,所以暂时未能应用到临床中进行细菌耐药性高低的检测。

那么mNGS测序技术对细菌耐药性的检测与控制没有任何用处了吗?其实也不然,虽然在临床应用中还存在很多的问题而暂时不能很好的使用,但是耐药基因依然是国内外的一个重要的科研话题,比如探讨样本中的耐药基因的检测情况,优化检测方法,探讨样本中耐药基因来源或数量与临床耐药表型的相关性......

宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用的专家共识

继年由中华医学会发表的《医院获得性肺炎与呼吸机相关性肺炎诊断和治疗指南(年版)》首次介绍宏基因组学高通量测序在临床感染检测诊断中具有优势后,近日,由五十余名国内重症专家组成的专家小组于《中华急诊医学杂志》中联合发表了《宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用的专家共识》,围绕着宏基因组检测在临床上,尤其是危重症感染的应用作了进一步深入的探讨。这一发表再次证明了宏基因组(mNGS)微生物检测技术已在临床上广泛开展并受到了重视与认可,成为了急危重症感染快速、精准治疗的发展方向。

在专家共识中,专家们除了对mNGS技术在急危重感染中诊断应用中的作用作了肯定外还分享了mNGS应用中的适应症、检测流程及临床解读。

01

适应症

专家们列举和推荐了mNGS在急危重症感染患者中应用的主要适应症。同时指出,符合以下适应症者,应尽快采集标本进行检测:

病情危重需要尽快明确病原体;

特殊病人如免疫抑制宿主、合并基础疾病、反复住院的重症感染患者需要尽快明确病原体;

传统微生物检测技术反复阴性且治疗效果不佳;

疑似新发病原体、临床上提示可能有一定的传染性;

疑似特殊病原体感染;

长期发热和/或伴有其他临床症状、病因不明的感染。

02

检测的基本流程和质控

实验流程包括:样本采集、样本处理、提取核酸、文库制备及上机测序、内参及对照品。

生物信息分析:质量控制、数据过滤、序列比对、报告生成。

检测报告包括:检测病原微生物列表、检出病原序列数量、所检测病原范围、检测方法及检测技术说明;同时对相关专业术语进行解释说明,并注明检测方法的局限性、检测灵敏度和特异性等。

mNGS检测报告和临床解读常用概念:检出序列数(reads)、深度、离散度、基因组覆盖度和微生物丰度。

03

临床应用和结果解读原则

mNGS不能完全取代常规的检测技术,与传统方法联合使用可提高病原体诊断的敏感性和特异性。

mNGS报告中检出序列数较高、基因覆盖度高,表示检测到该微生物;在排除背景菌污染和定植菌的情况下,可以考虑该微生物是致病病原体。

mNGS对胞内菌和厚壁微生物检出率低。

mNGS信息量大,在报告中未能列举全部病原体,如果临床有疑似特殊病原体感染,可以追溯到原始数据库进行查询。

RNA检测要求条件较高。

对于严重感染、生命体征不稳定患者,在病原体不明确的情况下进行广谱抗菌药物治疗,一旦mNGS或者传统病原学获得致病病原体后,针对病原体进行精准治疗。

mNGS可以早期发现病原体,指导抗菌药物的精准选择。

当前的mNGS尚不能完全指导耐药菌感染药物的选择。

04

尚存在问题

背景菌:应结合报告和辅助检查判断;

胞内菌/真菌检出率低;

RNA病原体的检测需优化;

耐药检测还存在一定困难。

分享原文如下:

中国腹腔感染诊治指南(版)

中华医学会外科学分会外科感染与重症医学学组

中国医师协会外科医师分会肠瘘外科医师专业委员会

中国实用外科杂志,,40(1):1-16

Chineseguidelineforthediagnosisandmanagementofintra-abdominalinfection(edition)ChineseSocietyofSurgicalInfectionandIntensiveCare,ChineseSocietyofSurgery,ChineseMedicalAssociation;ChineseCollegeofGastrointestinalFistulaSurgeons,ChineseCollegeofSurgeons,ChineseMedicalDoctorAssociation

Correspondingauthor:RENJian-an,E-mail:jiananr

nju.edu.cn

Keywordsintra-abdominalinfection;surgery;sourcecontrol;antimicrobialtherapy;diagnosis;nutritiontherapy

腹腔感染;手术;感染源控制;抗菌治疗;诊断;营养治疗

腹腔感染(intra-abdominalinfection,IAI)是腹部外科常见病,可继发于消化道的穿孔、坏死与坏疽,如胃十二指肠消化性溃疡穿孔、胃肠道肿瘤因梗阻和放化疗合并的穿孔;化脓性阑尾炎与阑尾穿孔、肠梗阻与肠坏死也会引起IAI。IAI也是腹部外科手术的常见并发症[1],如胃肠道肿瘤手术后并发的肠外瘘。作为住院病人中第二高发的感染性疾病[2],IAI病人的病死率可达20%,严重影响公共卫生安全。

本指南的研究对象为年龄18周岁及以上的成人IAI病人,儿童病人不在本指南涉及范围内。将成人IAI分为社区获得性腹腔感染(

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